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【饲料】昆虫抗菌肽及其利用
　　提要:抗菌肽是昆虫体液免疫中重要的抗菌因子,具有广谱抗菌性。不仅能杀死革兰氏阳性及阴性菌,还有抗真菌、病毒、原虫及抑制癌细胞的活性。本文简述国内外抗菌肽的研究状况以及抗菌肽在转基因植物、动物方面的应用成果及存在的问题。
　　关键词：抗菌肽；昆虫中　

赣州市圆梦人保健品圆梦人伴侣专卖　无公害饲料营销总监:郭晓成/编辑　　

　　　抗菌肽(antibacterialpeptide)是具抗菌活性的小分子蛋白质,是宿主先天性非特异性防御系统的重要组分。迄今为止在昆虫、被囊动物、鸟类、哺乳动物、植物等多种生物中发现了100多种内源性抗菌肽。抗菌肽具有分子量小,理化性质稳定,抗菌谱广及材料来源丰富等优点,抗菌肽不仅能作用于细菌、真菌、病毒以及其他一些原核生物,对肿瘤治疗也有一定的作用。抗菌肽对生物的天然免疫起关键作用。20世纪80年代初,Steiner[1]及Salsted等[2]首次分离到昆虫的抗菌多肽天蚕素(cecropin)和防御素(defensin),从此人们开始关注这类抗菌多肽,研究了其遗传免疫性、寄主防御系统、膜蛋白的相互作用、蛋白的修饰和分泌等,从而将这些抗菌多肽开发成有应用价值的食品添加剂和药物。
　　1　昆虫抗菌肽的种类
　　
　　昆虫产生的抗菌多肽是昆虫免疫的效应物。昆虫的抗菌肽属阳离子碱性多肽,大致可分为以下4类:第一类是天蚕素,含有31～39个氨基酸残基,一般不含有半胱氨酸,由鳞翅目和双翅目昆虫产生。第二类是昆虫防御素,含有38～43个氨基酸残基,其结构与动物和某些植物的防御素相似。防御素大量存在于昆虫血淋巴液中,至今已在双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目和蜻蜓目中发现了30多种防御素,主要杀死革兰氏阳性菌。最近从果蝇中分离到抗菌多肽drodomycin,有38%的氨基酸序列与植物防御素相似,表明其与植物多肽的进化有一定的同源关系。第三类是分子量为2～4KD富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽,如从意大利蜜蜂中分离到的蜜蜂肽apidaecin和abaecin(分子量分别为2.0KD和4.0KD)等,该类抗菌肽主要抑制革兰氏阴性菌。第四类是分子量为8～30ｋＤ,富含甘氨酸的蛋白,如从麻蝇幼虫体内分离到的麻蝇毒素Ⅱ(sarcotoxinⅡ,分子量约为27KD),从绿蝇幼虫、粉甲幼虫虫体中分离到的双翅肽diptericin(分子量约为9KD)和鞘翅肽coleoptericin等,这些大肽间相互关系较远,属樗蚕素(attacin)的超家族成员。
2　昆虫抗菌肽的抗菌作用机理
　　
　　昆虫受伤后能诱导血细胞和脂肪体迅速产生并释放大量不同组分抗菌肽进入血液,杀死外来细菌,这些抗菌肽合成类似于免疫应答反应和哺乳动物急性期反应。这些基因的表达受KB相关模式调控元件,与哺乳动物中相类似的调节编码免疫和应急期蛋白基因的NFKB相关的反式激活蛋白二者共同调控[3]。
　　
　　当抗菌肽基因在体内通过细菌的脂多糖类(lipopolysaccharides，LPS)或死亡的细胞诱导表达时,外来的刺激信号激活转录激活因子NFKB,激活的NFKB识别并结合到抗菌肽基因5′Ｂ 上游的一段特定区域,从而激活抗菌肽基因的表达[4,5]。表达后产生的抗菌肽在水溶液中没有稳定的构象,只是在结合或接近细胞膜时才形成高级结构。对此有学者分别提出各自的观点：Merrifield等[6]认为,当抗菌肽与细胞膜疏水区域接触时,整个分子(从Ｎ端到Ｃ端)诱导出两亲性螺旋,抑菌过程可能首先是抗菌肽Ｎ端的带电氨基酸与细胞膜的极性集团静电吸引,并形成α 螺旋,沿螺旋轴翻转,嵌入细胞膜,破坏膜结构。Fink等[7]研究表明,抗菌肽Ｎ端(残基1～11)形成两亲性螺旋,中间部分(残基12～24)形成弹性转角,Ｃ端形成疏水螺旋。当抗菌肽作用于细胞膜时,Ｃ端疏水螺旋插入膜中,Ｎ端结合在膜表面,中间由弹性转角相连。Christensen等[8]提出,抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面,然后疏水性尾巴插入细胞膜中的疏水区域,通过改变膜构象,多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道。在上述的4类抗菌多肽中,天蚕素和防御素的抗菌机理研究得最为详细。

　　2.1　天蚕素的抗菌机理
　　
　　天蚕素为阳离子型分子,含有2个α 螺旋结构,此结构具有双亲和性。Ｎ 末端具有亲水性并含碱性氨基酸。含有碱性氨基酸的碱性部位与细菌细胞膜的磷脂亲和,疏水部位贯穿细菌细胞膜,从而使细菌细胞膜的电动势消失,ＡＴＰ含量迅速减少,这样使细菌细胞膜机能丧失,细菌死亡。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化对于抗菌蛋白保持其抗菌活性是极为重要的[9]。
　　2.2　防御素的抗菌机理
　　
　　昆虫防御素对革兰氏阳性、阴性菌均有杀伤作用。相对而言,对革兰氏阳性菌杀伤力更强,这可能是革兰氏阴性菌的细胞壁防碍防御素接触细胞膜。防御素分子含有6个半胱氨酸,形成3个二硫键,具有稳定的分子结构。这一结构与从哺乳动物体中分离到的防御素分子结构相同。防御素类抗菌肽的杀菌机理也是防御素分子作用于细菌细胞膜。分子中的二硫键与细菌细胞膜的心肌磷脂有很强的亲和作用。结合后形成离子通道,从而改变细胞膜的透性,将细菌杀死。防御素的杀菌活性中心部位为α 螺旋结构[10]。Ｃ 末端氨基酸的酰氨化对其保持抗菌活性也是极为重要的。研究发现,防御素附着在细菌表面后,除了本身对细菌的损伤外,还可以使细菌被吞噬细胞吞噬消化,起到调理素的作用。另有研究表明,过氧化氢(Ｈ2Ｏ2)与防御素有协同作用,此协同作用随Ｈ2Ｏ2浓度的增加而增加,使防御素易于进入其靶细胞膜或细胞内环境。此外,研究表明樗蚕素类抗菌肽的抗菌机理是阻碍细菌外膜蛋白的合成,富含甘氨酸类抗菌肽的抗菌机理是阻碍细菌肽聚糖的合成。
　　3　昆虫抗菌肽的应用
　　3.1　转抗菌肽基因植物
　　
　　昆虫抗菌肽对植物病原菌也表现出极强的抗菌活性。用基因工程方法将真核生物编码抗菌肽的基因导入作物并得以表达,以达到抗菌的目的是当前国内外研究的热点。Ｊａｙｍｅｓ[11]将天蚕素Ｂ基因导入烟草植株中,培育出抗烟草青枯病(Pseudomonassolanacearum)的烟草植株。Beltan等[12]将天蚕素B类似物SB 37的基因转入烟草中,发现可推迟烟草的发病时间,并可以降低发病率和死亡率。另有报道将attaciE基因转入苹果树可提高苹果树对梨火疫病(Erwiniaamylovora)的抗性[13]。最近有研究表明,编码一种稳定的cecropin类似物MB39的基因在转基因烟草中表达可抗烟草野火病(Pseudomonassyringaepv，tabaci)[14]。
　　
　　国内也已研究出抗烟草花叶病毒病(Tobaccomosaivirus，TMV)的转基因烟草。简玉瑜等[15]将天蚕素Ｂ基因转入水稻,培育出抗水稻白叶枯病(Xanthomonasoryzaepv，oryzae)的植株。贾士荣等[16]自1986年开始选定昆虫细胞产生的抗菌肽天蚕素进行马铃薯抗青枯病基因工程的研究,改造并构建了比天蚕素抗性能力更强的cecropinB、shivaA及WHD等抗菌肽基因,并导入我国7个马铃薯主栽品种中,转化出1050个转基因株系。
　　3.2　转抗菌肽基因动物
　　控制疟疾、黄热病等蚊传疾病的主要手段是开发高效的药物和疫苗,以及消灭传播介体(蚊等),切断传播途径。近年来通过遗传工程的方法,将对病原生物有抑制作用的抗菌肽基因导入传播介体(蚊)中,使其在昆虫体内高效稳定的表达,从而切断病原物的传播途径[17～19]。
　　
　　在天蚕素Ｂ基础上构建的杂合肽shiva3对疟原虫(Plasmodiumperghel)孢子的发育有毒害作用。在shiva3基因前连接一个谷胱苷肽(Gst)转移酶基因,组成融合基因Gshiva3作报告基因,从而得到一种转基因蚊子,此蚊子肠道内可合成并分泌shiva3,因此可以用于控制人疟疾的传播[18]。最近Vladimir等[19]以埃及伊蚊(Aedesaegypti)卵黄原蛋白基因(vitellogeningene，vg)启动子连接一段防御素Ａ(defensinA，DefA)基因,将vgDefA整合到埃及伊蚊的基因组中,获得的转基因蚊取食血液后,激活防御素的生物合成,并在血淋巴中大量积累,其体内活性能保持长达22ｄ。
　　3.3　抗菌肽的抗癌作用
　　
　　抗菌肽不仅能作用于细菌、病毒以及其他一些原核生物,对肿瘤治疗也能起到一定的作用。近年来,国内外竞相报道了抗菌肽的抗癌作用。抗菌肽作用于癌细胞后,可使细胞膜破损,细胞内部结构发生明显变化,线粒体出现空泡化,嵴脱落,核膜界限模糊不清,甚至核内容物外泄。抗菌肽还可以断裂癌细胞的核ＤＮＡ,并抑制ＤＮＡ的再合成,从而杀死癌细胞[20]。另一方面,抗菌肽调动机体的免疫机能,从体液免疫方面起到抵抗癌细胞的作用。
　　4　昆虫抗菌肽研究存在的问题及展望
　　
　　抗菌肽具有分子量小、理化性质稳定、水溶性好、杀菌谱广等优点。将昆虫抗菌肽基因导入动植物,培育抗病新品种已成为一个非常诱人的研究领域,国内外均有成功的报道。可以预测,作为新型抗生素及新型药物,抗菌肽将在农业、食品业、工业、卫生用品和临床医学等方面发挥重要作用。但昆虫抗菌肽分子小,易被蛋白酶降解,影响基因的高水平表达。此外,小分子物质的分离、纯化比较困难,这些都是抗菌肽基因工程需要解决的问题。抗菌肽一级结构和作用时的空间分子结构与生物活性的关系还需要进一步研究。

未完待续：[中草药饲料13]昆虫抗菌肽及其在动物中的应用（三）【昆虫抗菌肽作用机理研究现状